产品介绍

Real Time PCR Easy^TM-Taqman试剂盒提供的2× Real PCR Easy^TM Mix-Taqman是一种使用特异荧光探针进行Real Time PCR扩增反应的全新预混系统，能大幅度提高产物特异性和反应灵敏度。同时，提供ROX作为内参染料。该Real Time PCR Mix扩增效率高，能更灵敏的、更直观的反应目的模板DNA的浓度。

2× Real PCR Easy^TM Mix-Taqman包含本公司特有的热启动ForegeneTaq DNA Polymerase，该酶相对于普通Taq酶具有扩增效率高、特异性扩增能力强、错配率低等优点。用于荧光定量PCR反应可减少非特异性扩增，提高PCR的准确性。

试剂盒应用

荧光定量PCR进行模板定量分析/常规PCR扩增/可用于等位基因的检测。

试剂盒内容

2× Real PCR Easy^TM Mix-Taqman：包含福际生物特别改造的热启动Taq DNA Polymerase、MgCl₂、优化配比的dNTPs、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等。PCR反应时，只需将适当的裂解混合液、引物、DNase-ddH2O添加到2× Real PCR Easy^TM Mix-Taqman中即可用于PCR反应。

ROX Reference Dye：一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪上，用于调整PCR加样误差所引起的 PCR管与管之间的差异。不同仪器所需ROX Reference Dye浓度不同，用户可以根据仪器的推荐浓度添加。

DNase-Free ddH2O：超纯水，用于PCR反应。

试剂盒原理

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。再通过实时监测整个PCR进程荧光信号的积累，与标准曲线对比进行定量分析。

Real Time PCR引物设计原则

Forward Primer和Reverse Primer

进行Real TimePCR，引物设计非常重要。引物关系到PCR扩增的特异性、高效性等，可以参照以下原则进行引物设计：

u  引物长度：18-30bp。

u  GC含量：40-60%。

u  Tm值：引物设计软件，如Primer 5，可以给出引物的Tm值。上下游引物的Tm值应    尽量接近。也可以使用Tm计算公式：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)。进行PCR时，一般选择低于引物Tm值5℃的温度作为退火温度（相应的提高退火温度可以增加PCR反应的特异性）。

u  引物及PCR产物：

v  设计引物PCR扩增产物长度最好在100-150bp。

v  应尽量避开在模板的二级结构区域设计引物。

v  避免上下游引物3’端之间形成2个或2个以上的互补碱基。

v  引物3’端碱基不能存在多余3个连续的G或C。

v  引物自身不能存在互补结构，否则会形成发夹结构，影响PCR扩增。

v  引物序列中ATCG应尽量分布均匀，3’端碱基避免为T。

Probe

探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp-150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。一般按照以下原则进行Probe的设计：

u  探针位置尽可能地靠近上游引物。

u  探针长度应在15-45bp(最好是20-30bp)，以保证结合特异性。

u  检测探针的DNA折叠和二级结构。

u  Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃(至少要5℃)，GC含量在40%-70%。

u  探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5’G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。

u  整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。

u  为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。