荧光定量PCR试剂盒-SYBR Green I染料法

产品名称	荧光定量PCR试剂盒-SYBR Green I染料法 Real Time PCR Easy^TM-SYBR Green I
货号	QP-01012	QP-01014
规格	500 × 20 μL rxns	2000 × 20 μL rxns
价格	￥827.00	￥2,648.00
描述	使用SYBR Green I进行Real Time PCR扩增反应，能大幅度提高产物特异性和反应灵敏度，荧光强度为同类产品的3-5倍。

产品介绍

Real Time PCR Easy^TM-SYBRGreen I试剂盒提供的2× Real PCR Easy^TM Mix-SYBR是一种使用SYBR Green I进行Real Time PCR扩增反应的全新预混系统，能大幅度提高产物特异性和反应灵敏度。同时，提供ROX作为内参染料。该试剂盒的荧光强度为同类产品的3-5倍，能更灵敏的、更直观的反应目的模板DNA的浓度。

2× Real PCR Easy^TMMix-SYBR包含本公司特有的热启动ForegeneTaq DNA Polymerase，该酶相对于普通Taq酶具有扩增效率高、特异性扩增能力强、错配率低等优点。用于荧光定量PCR反应可减少非特异性扩增，提高PCR的准确性。

试剂盒应用

荧光定量PCR进行模板定量分析/常规PCR扩增。

储存条件

本试剂盒避光保存于-20°C；若频繁使用，也可置于4°C短期保存(限10天内用完)。

试剂盒内容

2× Real PCR Easy™ Mix-SYBR：包含福际生物特别改造的热启动Taq DNA Polymerase、MgCl₂、优化配比的dNTPs和SYBR Green I、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等。PCR反应时，只需将适当的裂解混合液、引物、DNase-ddH2O添加到2× Real PCR Easy^™Mix-SYBR中即可用于PCR反应。

ROX Reference Dye：一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪上，用于调整PCR加样误差所引起的 PCR管与管之间的差异。不同仪器所需ROX Reference Dye浓度不同，用户可以根据仪器的推荐浓度添加。

DNase-Free ddH2O：超纯水，用于补齐扩增体系剩余体积。

试剂盒原理

试剂盒使用了热启动Foregene Taq DNA Polymerase进行PCR扩增，通过检测反应液中SYBRGreen I的荧光强度，达到监控PCR产物扩增量的目的。在PCR反应体系中，加入过量SYBRGreen I荧光染料，SYBR Green I荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBRGreen I染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBRGreen I与双链DNA结合后发出荧光，可以通过检测反应体系中的SYBRGreen I荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。

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Real Time PCR引物设计原则

Forward Primer和Reverse Primer

进行Real TimePCR，引物设计非常重要。引物关系到PCR扩增的特异性、高效性等，可以参照以下原则进行引物设计：

u 引物长度：18-30bp。

u GC含量：40-60%。

u Tm值：引物设计软件，如Primer 5，可以给出引物的Tm值。上下游引物的Tm值应尽量接近。也可以使用Tm计算公式：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)。进行PCR时，一般选择低于引物Tm值5℃的温度作为退火温度（相应的提高退火温度可以增加PCR反应的特异性）。

u 引物及PCR产物：

v 设计引物PCR扩增产物长度最好在100-150bp。

v 应尽量避开在模板的二级结构区域设计引物。

v 避免上下游引物3’端之间形成2个或2个以上的互补碱基。

v 引物3’端碱基不能存在多余3个连续的G或C。

v 引物自身不能存在互补结构，否则会形成发夹结构，影响PCR扩增。

v 引物序列中ATCG应尽量分布均匀，3’端碱基避免为T。

说明书 

Real Time PCR EasyTM-SYBR Green I Instruction Manual.pdf
产品文献 
MSDS 
COA 

无扩增信号

Answer

1. 试剂盒保存不当导致SYBR失效或者试剂盒过期导致SYBR荧光信号丢失。
建议：试剂盒打开后，其中的试剂要避光-20℃保存，且不能经常冻融；购买新的Real Time PCR Kit试剂盒进行相关实验。
2. 试剂盒中的Taq DNA Polymerase因试剂盒保存不当或过期而失去活性。
建议：确认试剂盒的保存条件；重新在PCR体系中添加适量Taq DNA Polymerase或者购买新的Real Time PCR Kit试剂盒进行相关实验。
3. DNA模板中存在大量的Taq DNA Polymerase的抑制因子。
建议：重新纯化模板或降低模板的使用量。
4. Mg²⁺浓度不适合。
建议：我们提供的2× Real PCR Mix的Mg²⁺浓度为3.5 mM。但针对有些特殊的引物和模板可能需要的Mg²⁺浓度较高，因此可直接添加MgCl₂进行Mg²⁺浓度的优化，建议每次增加0.5mM的Mg²⁺进行优化。
5. PCR扩增条件不适合、引物序列或者浓度不当。
建议：确认引物序列的正确性以及引物没有降解；扩增信号不好时，可尝试降低退火温度，适当调整引物浓度等。
6. 模板用量问题，太少或过多。
建议：可进行模板线性化梯度稀释，选择PCR效果最好的模板浓度进行Real Time PCR实验。
NTC出现过高的荧光值

Answer

1. 在操作过程中导致的试剂污染。
建议：更换新的试剂进行Real Time PCR实验。
2. PCR反应体系配制时发生污染。
建议：操作时进行必要的防护措施，比如：戴乳胶手套，使用带滤芯的枪头等。
3. 引物出现降解，引物降解会导致非特异性扩增出现。
建议：可使用SDS-PAGE电泳检测引物是否降解，更换新的引物进行Real Time PCR实验。
出现引物二聚体或非特异性扩增

Answer

1. Mg²⁺浓度不适合。
建议：我们提供的2× Real PCR Easy^TMMix的Mg²⁺浓度为3.5 mM。但针对有些特殊的引物和模板可能需要的Mg²⁺浓度较高，因此可直接添加MgCl₂进行Mg²⁺浓度的优化，建议每次增加0.5mM的Mg²⁺进行优化。
2. PCR退火温度过低。
建议：每次增加1℃或者2℃进行PCR退火温度的优化。
3. PCR产物太长。
建议：Real Time PCR产物长度最好在100-150bp之间，不要超过500bp。
4. 引物出现降解，引物降解会导致很会飞特异性扩增出现。
建议：可使用SDS-PAGE电泳检测引物是否降解，更换新的引物进行Real Time PCR实验。
5. PCR体系不当，或体系太小。
建议：PCR反应体系太小会导致检测精度降低。最好使用定量PCR仪推荐的反应体系重新进行Real Time PCR实验。
定量值重复性差

Answer

1. 仪器故障。
建议：仪器的每一个PCR孔之间可能存在误差，在温度管理或检测时产生重现性较差现象。请根据相应仪器的说明书进行点检。
2. 样品纯度不好。
建议：样品不纯会导致实验的重复性较差，这包括模板、引物的纯度。最好进行模板的再纯化，引物最好使用SDS-PAGE纯化。
3. PCR体系配制放置时间过长。
建议：Real Time PCR体系配制好后立即用于PCR实验，不要搁置太长时间。
4. PCR扩增条件不适合、引物序列或者浓度不当。
建议：确认引物序列的正确性以及引物没有降解；扩增信号不好时，可尝试降低退火温度，适当调整引物浓度等。
5. PCR体系不当，或体系太小。
建议：PCR反应体系太小会导致检测精度降低。最好使用定量PCR仪推荐的反应体系重新进行Real Time PCR实验。

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