师兄师兄，反转录真的好简单啊，操作说明都只有豆腐大一块，提RNA的有两三页呢！

是不是觉得组分一加、模板一加，上机，so easy？

是啊是啊，就这我还能出错？

哦，这么自信？那我考考你，反转录体系组成都有哪些？

这个我知道！酶、buffer、引物、模板RNA、无酶水！

可以的嘛，现在大多试剂盒都提供预混Mix了，我们只需要加引物、模板、水就可以了。那么，模板用量是多少你知道不？

…随便加点？

这？！…要不要去基因组RNA？

要，…还是不要？

算了吧你…来，师兄给你好好说说。

一般来说，反转录模板RNA添加量要严格按照产品说明书建议用量添加，过多会抑制反转录效率，过少会使下游PCR、qPCR实验cDNA模板量过低。而且，要注意根据提取纯化的RNA浓度调整添加体积哦。

如果你下游实验为qPCR，可以使用福际生物的RT Easy II，这个是qPCR专用第一链cDNA合成试剂盒，预混了优化配比的Oligo(dT)引物与随机引物，可以省略添加引物的步骤。

但你的研究样本是miRNA，就要根据说明书建议量添加你自己合成的特异性引物。

哦，我明白了。那我做的是RNA，怎么又扯上基因组DNA了呢？

传统方法提取RNA的过程中极易混入少量基因组DNA，因此在后续检测过程中有可能出现假阳性现象，会影响对后续实验结果的判断。这时你就要考虑去除残留的基因组DNA。

可以设置无反转录对照（no-RT control）——即含有除反转录酶以外的所有成分——来确定是否存在基因组DNA干扰。

要避免残留基因组DNA对实验结果的影响，可以在提取时使用DNA去除效果好的福际总RNA提取试剂盒；或者使用去基因组的反转录产品，比如福际的RT Easy II (with gDNase)。还有一种方法是设计跨内含子引物，也可以达到避免基因组DNA干扰的目的。

哦，原来反转录还有这么多坑，谢谢师兄，我去做实验了~