产品介绍

试剂盒提供的2× Blue Real PCR Easy™ Mix-SYBR是一种使用SYBR Green I进行Real Time PCR扩增反应的全新预混系统，能大幅度提高产物特异性和反应灵敏度。同时，提供ROX作为内参染料。该试剂盒的荧光强度为同类产品的3-5倍，能更灵敏的、更直观的反应目的模板DNA的浓度。

2× Blue Real PCR Easy™ Mix-SYBR包含抗体法修饰的热启动酶Foreasy HS Taq DNA Polymerase，该酶相对于普通Taq酶具有扩增效率高、特异性扩增能力强、错配率低等优点；同时还包含蓝色指示剂，便于移液示踪，有效减少移液错误。

运输及储存条件

1.     运输条件：全程低温冰盒运输。

2.     保存条件：避光保存于-20℃；若频繁使用，也可置于4℃短期保存(限10天内用完)。

试剂盒内容

2× Blue Real PCR Easy™ Mix-SYBR：包含抗体修饰的热启动酶Foreasy HS Taq DNA Polymerase、MgCl2、优化配比的dNTPs和SYBR Green I、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂、稳定剂以及指示剂等。PCR反应时，只需将适当的模板、引物、DNase-ddH2O添加到2× Blue Real PCR Easy™ Mix-SYBR中即可用于PCR反应。

ROX Reference Dye：一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪上，用于调整PCR加样误差所引起的 PCR管与管之间的差异。不同仪器所需ROX Reference Dye浓度不同，用户可以根据仪器的推荐浓度添加。

DNase-Free ddH2O：超纯水，用于补齐扩增体系剩余体积。

试剂盒原理

试剂盒使用了热启动Foregene Taq DNA Polymerase进行PCR扩增，通过检测反应液中SYBRGreen I的荧光强度，达到监控PCR产物扩增量的目的。在PCR反应体系中，加入过量SYBRGreen I荧光染料，SYBR Green I荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBRGreen I染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBRGreen I与双链DNA结合后发出荧光，可以通过检测反应体系中的SYBRGreen I荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。

Real Time PCR引物设计原则

Forward Primer和Reverse Primer

进行Real TimePCR，引物设计非常重要。引物关系到PCR扩增的特异性、高效性等，可以参照以下原则进行引物设计：

u  引物长度：18-30bp。

u  GC含量：40-60%。

u  Tm值：引物设计软件，如Primer 5，可以给出引物的Tm值。上下游引物的Tm值应    尽量接近。也可以使用Tm计算公式：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)。进行PCR时，一般选择低于引物Tm值5℃的温度作为退火温度（相应的提高退火温度可以增加PCR反应的特异性）。

u  引物及PCR产物：

v  设计引物PCR扩增产物长度最好在100-150bp。

v  应尽量避开在模板的二级结构区域设计引物。

v  避免上下游引物3’端之间形成2个或2个以上的互补碱基。

v  引物3’端碱基不能存在多余3个连续的G或C。

v  引物自身不能存在互补结构，否则会形成发夹结构，影响PCR扩增。

v  引物序列中ATCG应尽量分布均匀，3’端碱基避免为T。